病害的发生对农业生产来说是巨大的威胁，它会造成作物的减产甚至是绝收。香蕉叶斑病可造成香蕉减产达30%~50% (桑利伟和郑服丛, 2006)；葡萄白腐病在流行年份可造成20%~80%的损失(王忠跃, 2009, 中国农业出版社, pp.41-42)。目前，对植物病害的防治主要是运用施用农药的防治方法，虽然具有防治作用，但也对环境产生了污染。中国目前是全世界施用农药和化肥最多的地区之一，农药的使用不可避免地会产生土壤污染、水污染以及大气污染，最终威胁到人类的健康安全，所以培育抗病性品种是最环保、最经济的方法，尤其是随着分子生物学与分子技术的不断进步，研究者已从众多的植物中克隆得到了抗病基因，如番茄的Pto基因(Martin et al., 1993)，烟草的N基因(Whitham et al., 1994)以及小麦Lr10基因(Feuillet et al., 1997)。

至今，分离与克隆抗病基因的方法已有多种，如转座子标签法、图位克隆法、表型基因克隆法、mRNA差异显示技术等等。通过这些方法，克隆获得约50多个植物的抗性(resistance, R)基因，其中，NBS-LRR类是最大的一类，NBS存在于真核生物的许多蛋白中，NBS区域主要负责ATP的水解以及释放信号。LRR是长度在24个氨基酸之内的多重重复，它是蛋白质相互作用的平台，而且是蛋白质活化作用的调控构件。通过分析，一些R基因产物的氨基酸序列具有高度保守的区域。根据这些保守区域设计引物来扩增基因组DNA或cDNA可获得RGA，这为分离抗病基因或抗病相关序列提供了一种新方法。NBS-LRR类基因的研究还可与分子标记技术相联系，通过一些分子标记，可将一些RGAs定位在相应的遗传图谱上，从而逐步接近抗病基因，这不仅有助于对抗病机制的分析与认识，而且也能加速挖掘抗病基因的进程。我们对近年来国内外有关NBS-LRR类基因的介绍做了一个较系统的总结，以期为更好的利用NBS-LRR类基因来克隆和分离抗病基因奠定基础。

1 R基因
Flor 于1971年提出了著名的基因对基因假说(Flor, 1971)，他认为基因对基因相互作用的显著标志是过敏性反应(hypersensitive reaction, HR)的诱导，HR是植物抵抗病原菌的一种机制与植物抗病性有直接关系。该假说成为了目前克隆植物抗病基因的理论基础。

植物的抗病性是植物为了抵抗病原物的侵染、扩展和危害而在形态结构和生理生化等方面在时间和空间上的综合表现，其实质是抗病性基因表达的结果，通过抗病基因的表达和相关基因的调控而实现的。植物抗病性的强弱决定了抗病基因的表达强度和速度(徐炎, 2000, 西北农林科技大学, pp.15-16)。植物的防御反应可以分为植物基本防御与R基因调节防御两种类型，绝大多数R基因含有NBS-LRR区域，它是植物免疫系统的重要组份(Shang et al., 2009)。R基因在植物的病害防御过程中起着非常重要的作用，一旦病原菌侵入植物表皮将遇到R基因和avr基因的互作，即植物的非寄主抗病性(孙文丽等, 2008)。

2 RGA与R基因
抗病基因同源序列(resistance gene analog, RGA)是一种存在于植物基因组中具有某些特定保守结构域的DNA区段。抗病基因克隆对于培育抗病作物新品种和研究病原物与寄主作物之间互作的分子机制具有重要的意义。根据植物抗病基因保守序列结构特点设计引物来扩增基因组DNA或cDNA可获得抗病基因同源序列，为筛选抗病基因或抗病相关基因提供了一种有效手段(贺超英等, 2001, www.scichina.com)。

RGA与R基因之间的关系主要有三种(王华峰, 2004)。第一，RGA是R基因或假基因的一部分。第二，RGA与R基因紧密连锁。第三，RGA与目的抗病基因无关。连锁分析表明很多RGA与R基因紧密连锁，甚至就是R基因的一部分，这为进一步筛选克隆目的R基因奠定了重要的基础。因RGA结构域不同可分为4类，第一类是NBS-LRR类抗病基因。这类基因的特点是在它们编码蛋白的近N端存在着NBS，而在它们的近C端则由LRR组成。这一类蛋白一般存在于细胞质中，如烟草抗花叶病毒基因N基因。第二类是LRR-TM类抗病基因，它们的N端存在一个胞外LRR，而在C端具有由疏水氨基酸组成的跨膜区(TM)，如番茄抗叶霉病不同生理小种的基因cf-2，cf-4以及甜菜抗包囊线虫的基因Hs1。第三类是LRR-TM-STK类抗病基因，它含有与cf-9蛋白相似的胞外LRR受体结构域，又含有与Pto蛋白相似的胞内STK结构域，在这两个区域之间存在一个跨膜区(TM)，如水稻抗白叶枯病基因Xa21。第四类是STK类抗病基因，它没有LRR结构域，如番茄Pto，Fen，Lr10基因。在这四类中以NBS类抗病基因为主，NBS即核苷酸结合位点(Nucleotide binding site)，LRR为富含亮氨酸重复(Leucine-rich repeats)。Meyers等(1999)的研究结果表明：双子叶植物中同时存在TIR-NBS-LRR和non TIR-NBS-LRR两类抗病基因，并且non TIR-NBS-LRR类抗病基因中的Kinase-2的共有序列可总结为(Y/V)(L/V)(L/I/V)V(L/V)DD(I/V)W，最后一个氨基酸为天冬氨酸(D)，而在TIR-NBS-LRR中Kinase-2的共有序列可总结为(V/L/I)(L/I/V)(L/I/V)V(L/I/V) DD(V/I)X，最后一个氨基酸为任意氨基酸，通常为色氨酸(W)。因此在Kinase-2末端中，当最后一个氨基酸为色氨酸(W)时，该基因属于non-TIR-NBS-LRR 类型；而当最后一个氨基酸为天冬氨酸(D)时，则该基因为TIR-NBS-LRR类抗病基因。亚麻的抗锈病基因L6和烟草抗花叶病毒基因N基因都属于TIR-NBS-LRR类抗病基因，而拟南芥的抗丁香假单孢杆菌基因RPS2和RPS5则属于non-TIR-NBS-LRR类抗病基因(Seehalak et al., 2011)。

3 NBS-LRR的结构与功能
NBS (nucleotide binding site, NBS)即核苷酸结合位点。NBS区域主要负责ATP的水解以及释放信号，NBS存在于真核生物的许多蛋白中，如ATPase，延伸因子异质三聚体， GTP结合蛋白，R基因编码蛋白，这些蛋白对细胞的生长分化，细胞骨架的形成，小泡的运输和防御反应都有关键性作用(秦跟基等, 1999)。

NBS有三个区域组成(李春来和张怀渝, 2004)。第一区域为P-LOOP，又称Kinase-a；第二区域为kinase-2a；第三区域为Kinase-3a。

LRR (leucine-rich repeats, LRR)即富含亮氨酸重复。LRR是长度在24个氨基酸之内的多重重复，它含有多个亮氨酸或其它亲水残基，也可含有较规律分配的脯氨酸和天冬氨酸，从而决定着含LRR蛋白的晶体结构(Dixon et al., 1996)。有人认为LRR为蹄铁状结构(孙文丽等, 2008)，也有人认为为近似卷曲弹簧的三维结构(李春来和张怀渝, 2004)。LRR是蛋白质，在有机体中占有较大面积，它是蛋白质相互作用的平台，而且是蛋白质活化作用的调控构件，在功能方面这种富亮氨酸的结构域决定着与配体(Avr基因的产物)结合的专一性,即决定了寄主与病原的特异性识别，在一定程度上可以解释基因对基因的相互作用。氨基末端以及羰基末端区域的LRR具有不同的功能，氨基末端区域的LRR具有调节活化的作用，位于羰基末端区域的LRR具有识别细菌的功能(Belkhadir et al., 2004)。Dixon等(1996)提出了LRR促进R基因产物与其它参与抗病信号传导的蛋白之间的结合等模型。植物在识别病原菌变化时，氨基酸替换和LRRs的数目会发生变化，这可使植物获得新的抗性。Tamura等(2011)也认为植物识别病原物的能力取决于R基因的类型，而新的R基因获得可以通过氨基酸替换和发生在编码LRR的区域内的LRRs重复数目的改变而得到。

NBS-LRR蛋白为组配各种假定的调控因子提供了平台(CC, TIR, NBS, 氨基末端LRR结构)，这些调控因子对于信号的控制来说是必须的，这些区域可能与位于分子内部的羰基末端的LRR调控区域相联系。NBS-LRR蛋白通过传动能产生一些潜在的信号，NBS-LRR蛋白信号发送的能力受到两方面的控制，这两方面都与负调控相关，一方面是激活作用，NBS-LRR蛋白是动态的而且会受到不适当的激活而变得不稳定。另一方面是灭活作用，不适当的激活对细胞有毒害的影响，但是负调控可通过钝化作用(灭活作用)进行调节，这样就建立了稳定的而且具有活性信号的构象(Belkhadir et al., 2004)。

4抗病基因同源序列的获得及其在染色体上定位
目前所做植物上的抗病基因同源序列的分离与鉴定大部分都是根据NBS-LRR的保守区段进行引物的设计，根据已克隆的NBS-LRR类抗病基因保守区域P- loop和疏水结构域(GLPLAL)设计引物，采用PCR技术从植物组织DNA或cDNA中扩增和分离得到RGAs，如小麦(王海燕等, 2006)﹑甘蔗(阙友雄等, 2009a)﹑水稻(杨勤忠等, 2001)﹑拟南芥(王岩等, 2009)﹑香蕉(袁克华等, 2009)﹑斑茅(阙友雄等, 2009b)﹑巴西橡胶(张影波等, 2009)﹑花生(刘宇等, 2010)﹑咖啡(Hendre et al., 2011)﹑棉花(Azhar et al., 2011)﹑野生稻(徐靖等, 2010)﹑草莓(Martinez Zamora et al., 2004)。虽然尚未成功地克隆出抗病基因,但却分离到许多结构上与R基因类似的序列，这些序列均含有NBS-ARC保守结构域，与已知抗病基因相应区域相一致具有抗病基因NBS特征结构域(P环, 激酶2a等)。经氨基酸序列同源性比对得到的RGAs片段具有典型的NBS结构域，即P-loop (GGVGKTT)，Kinase-2a (VLDDVW)，Kinase-3a (GSR/KILVTTR)结构以及疏水结构域HD (hydrophobic domain) (阙友雄等, 2009a)。一些抗病基因同源序列可以与抗病基因归于一类，但同源性都不太高。

目前，研究者利用NBS-LRR设计引物得到RGAs，再通过与分子标记相结合，借助其遗传图谱将RGAs定位在染色体上，从而逐步找到抗病基因。如Madsen等(2003)研究大麦的抗病性，他们先根据NBS-LRR保守区段设计引物进行PCR，克隆，从而得到RGAs。再结合RFLP分子标记技术，将这些RGAs定位在大麦的遗传图谱上，而且这些RGAs大都紧邻在已知的抗病基因附近。最终得出RGAs可能就是抗病基因候补片段这一重要结论。另外Soriano等(2005)也利用相同的技术手段将杏子的一些RGAs定位在遗传图谱上。Collins等(1998)在玉米中鉴定了20个RGAs 并首先把他们作图到已知携带R基因的染色体区域，第二年又从玉米中成功克隆出了RP1-D基因。Chen等(2011)根据R基因保守序列LRR，NBS 和STK设计引物，在F₆重组自交系中扩增得到的多态性条带显示为单座位遗传，还发现以STK为引物获得的RGAs和小麦抗条锈基因之间存在一定连锁关系。Qi等(2011)利用分子标记技术将向日葵上抗锈蚀病基因R4基因在染色体上进行了定位，他采用位于NBS-LRR簇群内的分别位于抗锈蚀病基因R4基因两侧2.1 cM和0.8 cM处的ZVG61与ORS581作为分子标记，将抗锈蚀病基因R4基因定位于向日葵的13号连锁群上，通过筛选最终证明HA-R3是抗锈蚀病的最有效基因。Shi等(2011, www.springerlink.com)从茄科植物川椒CM334上得到了RGA (CAPRGC)，它与土豆抗花叶病毒基因高度相似，通过比较基因图谱研究揭示了CAPRGC与RX位于同一条染色体上，最终也证明了R基因的特异性不是保守的，但R基因的结构与功能是保守的这一推论。Kumar等(2010)从水稻的广谱抗病基因DHR9上分离出了抗病基因类似序列并采用RAPD﹑SSR﹑STS分子标记技术将鉴定出的6个NBS-LRR基因定位在水稻的12号染色体上，并把它们作为潜在的抗病基因。Bresson等(2011, www.newphytologist.com)通过构建杨树的基因图谱与遗传图谱以及BAC文库，并利用SCAR，SSR，以及STS分子标记，将杨树上分别控制叶锈病的质量抗性与数量抗性的Rus和R1基因定位在了杨树19号染色体NBS-LRR区域内，Rus位点间的间隔距离为0.8 cM，R1基因位点间的间隔距离为1.1 cM。

5 NBS profiling分子标记及相关技术的应用
目前，人们用NBS profiling标记技术来找寻NBS-LRR类的R基因及其RGA (裴冬丽和李成伟, 2009)，NBS profiling是一个产生R基因和RGAs分子标记的有力工具(Meyers et al., 1999)。NBS profiling可以用于产生一些和R基因和R基因簇紧密连锁的标记，从而用于构建基因图谱和定位克隆，以及是在可利用的种质内开发新的等位基因和挖掘抗病性新来源(Vander et al., 2004) 。NBS profiling在凝胶测序上可以产生一些可再生的多态性标记，这大大丰富了R基因和RGAs。

Calenge等(2005)利用NBS profiling在苹果上产生了43个标记，经过测序，23个标记鉴定为RGAs，并将标记定位于苹果基因图谱中17条连锁群上中的10条上，25个标记与苹果上抗疮痂病和霉病的重要基因或定量品质位点相接近。Vander等(2004)用NBS profiling技术在基因组水平上分析了大麦、马铃薯、番茄和莴苣的RGA的结构，发现这些作物经过引物扩增以及酶切产生的序列与已知的抗病基因和 RGA序列有50%~90%的相似度。Sayar-Turet等(2011)利用NBS profiling技术将土耳其冬小麦栽培品种和哈撒克斯坦冬小麦栽培品种以及欧洲冬小麦栽培品种区分开。Whitaker等(2010)利用NBS profiling与LRR profiling技术从距离玫瑰抗黑斑病Rdr3 9.1 cM的位置鉴定出一分子标记，并把它转化成SCAR标记用于分子标记辅助育种。Gennaro等(2009)利用NBS profiling技术从小麦染色体上分离出含有或缺失抗小麦叶锈病的Lr19基因，并采用STS标记技术发现其中一条序列AG15与抗小麦叶锈病的Lr19基因紧密连锁，最后通过结构分析与通过Southern杂交证明AG15属于R基因家族的NBS类，并发现AG15与小麦叶锈病的诱导有互为表达的关系，最终证明AG15是小麦抗叶锈病Lr19的候补基因。

6展望
R基因保守区为克隆抗病基因提供了新的方法。根据R基因保守区域合成引物已从不同的植物中克隆出R基因，虽然并未真正地克隆出抗病基因，但却分离到许多结构上与R基因类似的序列(RGA)，而且很多RGA与R基因紧密连锁，这为进一步筛选克隆目的R基因打下了基础。

根据R基因保守结构域来克隆R基因以及寻找与R基因或与RGA紧密连锁的标记也存在一些问题。首先有些非抗性基因同样具有NBS、LRR和丝氨酸∕苏氨酸激酶等保守结构域，因此克隆出的RGA未必都与R基因有关(秦跟基等, 1999)。其次RGA的分类也较混杂有的按推导的RGA间氨基酸的相似程度进行分类，如将相似性在50%以上的定为同一类，也有将相似性在70%以上的定为同一类，还有的将核苷酸水平在95%以上相似定为同一类(王华峰, 2004)。因而，对于RGA的研究要与其他的分子技术以及常规的育种技术相结合，这样才能得到更加可靠，准确的结果。RGA作为一种有力的工具势必会有助于抗病功能基因的发现和植物抗病机制的认识，并能加速挖掘抗病基因的进程。

作者贡献
李峰、张颖完成论文相关资料的收集与整理工作；李峰完成论文初稿的写作；刘崇怀、樊秀彩和张国海三位老师指导了论文的写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由现代农业产业技术体系专项资金(CARS-30-yz-1)和农作物种质资源保护项目(NB2011-2130135-34)共同资助。作者感谢中国农业科学院郑州果树研究所刘崇怀老师、张颖老师和樊秀彩老师的辛勤指导以及河南科技大学张国海老师在写作过程中的有益建议。

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